质粒dna的分离纯化和鉴定,质粒dna的分离纯化实验报告

　　在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
　　（一）、碱法
　　1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。
　　2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。
　　3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
　　4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。
　　5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。
　　6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
　　7、4℃下5000g离心15分钟。
　　8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。
　　9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。
　　10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。
　　11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。
　　12、4℃下12000g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。
　　13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。
　　[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。
　　2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。
　　3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃1小时),使DNA酶失活。

　　（二）、Wazard大量DNA纯化系统
　　碱法大量提取DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。
该系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细胞悬浮液，150ml 细胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA纯化树脂，125ml Wizard柱子洗脱溶液和10支Wizard带有存储离心管的柱子。
　　1、100-500ml细胞培养液置离心管中, 22-25℃下5000g离心10分钟, 所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。
　　2、加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时,溶液会变清,这一步需要20分钟。
　　3、加15ml中和溶液,立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。
　　4、14000g,22-25℃离心15分钟。
　　5、小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。
　　6、加0.5倍体积的异丙醇,混合均匀, 14000g 22-25℃下离心15分钟。
　　7、弃上清,悬浮DNA沉淀于2ml TE缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。
　　8、加10ml Wizard大量DNA纯化树脂溶液, 并涡旋混合。
　　9、每一个样品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega产品,与此配套)。
　　10、将树脂/DNA混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA混合液。
　　11、将树脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。
　　12、真空抽干所加入的洗脱。
　　13、再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干。
　　14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心5分钟。
　　15、取出柱子，真空抽干5分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离心5分钟。
　　16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE,1分钟后2500rpm(1300g)离心柱子/离心管5分钟。
　　17、取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子，储存在4℃或-20℃备用。
　　[注意] 1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125ml 95％乙醇。
　　 2. 纯化树脂必须混匀后再用.

　　（三）、Sephrose 2B柱纯化质粒DNA
　　碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理,仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B进行纯化,该方法具有快速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA纯化。
　　1、将Sepharose 2B经含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。
　　2、将至多1ml的DNA溶液铺在Sepharase 2B柱上。
　　3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)贮液瓶。
　　4、以1ml流出液为1份进行收集。
　　5、对每一管测定其OD260值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中。
　　6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g离心2分钟,将上层水相转入新管。
　　7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10分钟,然后4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。
　　8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。
　　9、沉淀真空抽干,重新溶于TE或无菌水中。

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